IN Cell User's Day 2010 講演要旨

IN Cell Analyzer 1000による細胞周期ヒストグラム描画方法の改良

長崎大学大学院医歯薬学総合研究科放射線医療科学専攻 鈴木 正敏

細胞周期解析では、フローサイトメーターによって測定された個々の細胞が持つDNA含有量に基づいて作成されたヒストグラムから各細胞周期の割合を算出する手法が広く利用されている。IN Cell Analyzerのようなイメージングサイトメーターを用いた場合でも、原理的には同様の細胞周期解析が可能であるが、加えて、特異的抗体を用いた蛍光免疫染色を組みあわせることでその発現量の細胞周期依存性のみならず、局在情報あるいは細胞形態の変化等、蛍光顕微鏡観察によって得られる多種多様な情報が加味された情報が一度に、かつ多量に解析することが可能となり、この点でファンクショナル分子イメージングにおいてイメージングサイトメーターを利用した幅広い解析が期待される。

我々はこのようなIN Cell Analyzerがもつ特性を利用して、放射線による細胞影響解析を行っている。放射線は非常に致死性の高いDNA損傷であるDNA二重鎖切断を細胞内に生成し、その損傷に起因したDNA損傷チェックポイント機構が各細胞周期で活性化することによって細胞周期停止が誘導される。放射線がん治療で用いられている高線量の放射線を正常細胞、あるいは固形腫瘍由来細胞株に照射した場合では、細胞形態の扁平化・巨大化に加えて老化マーカーである老化関連βガラクトシダーゼ染色に対して陽性を示す、などの細胞老化特有の変化を示す細胞死形態、老化様増殖停止が誘導されることを我々は見いだしてきた。放射線誘発老化様増殖停止で細胞死としての性質を付与している増殖停止の不可逆性はG1期、あるいはG2期でのDNA損傷チェックポイント機構の活性化維持に起因している為、この細胞死が誘導されるとS期の割合はほぼなくなる。我々がIN Cell Analyzer 1000を導入当初に細胞周期解析を行ったところ、G1期やG2期を示すと思われるピークが確認されたものの、それぞれのピークの半値幅は大きく、特にS期細胞を示す領域での解像度の低さから、S期の割合を正確に算出することは非常に困難であることが判明した。そこでGEヘルスケア・ジャパンサイエンティフィックサポート営業部の協力のもと、サンプル作成方法、画像取得条件、ならびに画像解析プロトコールの様々な視点から検討・改良を行った結果、フローサイトメーターによって作成された細胞周期ヒストグラムと比較しても同等のクオリティーをもつまでにそのパターンが改善された。本講演では、高い解像度を持つヒストグラム作成方法の確立に至るまでの過程やその応用について紹介する予定である。