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Location:ホーム実験手法別製品・技術情報タンパク質サンプル調製・前処理

タンパク質の定量

ディスポーザブルセル写真ここでは、溶液に含まれるタンパク質全体を対象とした分光光度計を用いたタンパク質定量についてご紹介します(特定のタンパク質を対象とした定量には、ELISAやウェスタンブロッティングなどの抗体を用いた手法があります)。タンパク質(アミノ酸)が本来持つ吸収ピークや、タンパク質に何らかの試薬を反応させることで得られる吸収ピークを利用し、分光光度計で測定される吸光度を元にタンパク質量を概算することができます。

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分光光度計を利用したタンパク質定量

それぞれの手法により、検出感度、簡便さ、用いる試薬、測定波長などが異なります。したがって、実施した手法によって定量値には誤差が生じます。

また、測定方法により妨害物質が異なるため、サンプル溶液にの性質を考慮して方法を選択する必要があります。定量を行うサンプル(目的タンパク質)が偏ったアミノ酸配列を持つ場合にも、定量法の選択に注意が必要です。

紫外吸収法

280 nm付近に吸収のあるトリプトファン・チロシン・フェニルアラニンの吸光度を測定し定量を行います。特別な操作は必要なく溶液の吸光度を測るだけであるため、簡便に定量を行えます。

測定波長: 260 nm, 280 nm
【定量範囲】

10 ~ 1,000 µg/ml

Warburg と Christian* が導き出した方程式をもとに、タンパク質量を算出します。

タンパク質濃度(mg/ml) = 1.55×[Abs280]-[Abs260]

より正確にタンパク質濃度を測定したい場合には、タンパク質ごとの固有式を求めることができます。あらかじめ濃度既知のタンパク質の260 nm、および280 nmの吸光度を測定して得られる係数をもとに、定量を行います。

タンパク質濃度 = (ファクター1)×([Abs280]-[Abs320])-(ファクター2)×([Abs260]-[Abs320])

* 参考文献: Biochemishes Zeitung 310, 384 (1941)
※ [Abs○○○] = 波長○○○nm における吸光度値

BCA法(ビシンコニン酸法)

ペプチド結合に反応させた銅イオンをBCA(ビシンコニン酸)を反応させ、その吸収ピークを測定します。界面活性剤の影響をあまり受けないことと、定量範囲が広いことが特長です。

測定波長: 562 nm
【定量範囲】

1 ~ 2,000 µg/ml

ブラッドフォード法(Bradford法)

CBB G-250色素をタンパク質と結合させてその吸収を測定します。反応時間が短いため操作が非常に簡便であること、発色が安定していることなどが長所です。

ローリー法BCA法と異なり、還元剤やEDTAは定量に影響を与えませんが、界面活性剤は定量を阻害します。

測定波長: 595 nm
【定量範囲】

1 ~ 100 µg

ローリー法(Lowry法)

ビューレット試薬に加えて、チロシン・トリプトファン・システインの側鎖と反応するFolin-Chiocalteuフェノール試薬を反応させ、その吸収ピークを測定します。

一般的に多く利用されていますが、操作に時間を要します。界面活性剤、EDTA、還元剤は定量を阻害します。

測定波長: 750 nm
【定量範囲】

1 ~ 100 µg

ビューレット法(Biuret法)

ペプチド結合と2価銅イオンを錯体形成させ、その吸収ピークを測定します。タンパク質の種類による発色の差が少ないことが特長ですが、感度は比較的低めです。ローリー法BCA法は、このビューレット法をベースとした改良メソッドです。

測定波長: 546 nm
【定量範囲】

130 mg/mlまで

2-D Quant Kit

2-D Quant Kit イメージ画像界面活性剤、還元剤、Ureaなどの影響を受けずにタンパク質を定量できるキットです。タンパク質の沈殿操作を挟み不純物を除去することで、阻害物質の非存在下でタンパク質定量を行います。

定量の原理はタンパク質と銅イオンの結合を利用したもので、非結合銅イオンの量を比色試薬と反応させることでタンパク質定量を行います。沈殿操作を行いますので他の定量法に比べると操作時間はかかります。

測定波長: 480 nm
【定量範囲】

0.5 ~ 50 µg

電気泳動によるタンパク質定量

画像解析ソフトウェアによって電気泳動パターンからシグナル強度を算出し、タンパク質量を概算する手法です。タンパク質量が既知であるサンプルを泳動したレーン全体のバンドシグナルと比較を行い、定量したいサンプルのタンパク質量を算出します。

検出は、CBBや蛍光染色試薬(例:Deep Purple Total Protein Stain Kit)を用いるのがよいでしょう。銀染色では定量ダイナミックレンジが低く、定量には向いていません。

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