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Location:ホーム実験手法別製品・技術情報タンパク質サンプル調製・前処理

SDS-PAGEのサンプル調製における注意点

普段何気なく行っているSDS-PAGEですが、いくつかの点を気をつけるだけでも結果を改善できる場合があります。きれいな泳動パターンが得られない場合に、参考になさってください。

このページの目次


変性処理の温度について

β-メルカプトエタノールとSDSを用いた変性処理は、95~100℃で3~5分の加熱処理が一般的に不溶性タンパク質に適したプロトコールとしてよく使用されます。しかし、100℃であまり長く加熱しすぎると、タンパク質が分解してしまうこともあります。

タンパク質の性質によっては、以下のような変性条件で試してみるのもよいでしょう。

  • 室温でオーバーナイト
  • 37℃で2-3時間
  • 70℃で30分

サンプル中のイオン夾雑物(塩)濃度について

SDS-PAGEの場合は、イオン夾雑物(塩)濃度がサンプルの移動度や泳動パターンに影響を与えることがあるため、塩濃度をなるべく下げます。一般的に、サンプルの塩濃度は0.5M以下を推奨しています。

しかし、実際には塩の種類によっても影響は変わってきます。リン酸イオンは、わずか0.01M~0.1Mの濃度で移動度に影響を与えることがあり、KClを含むサンプルではSDSが析出してしまうことがあります。

また、サンプル間の塩濃度差はなるべく揃えます。塩濃度が高いサンプルほど一般的に移動速度が遅くなるため、塩濃度の異なるサンプルを同時に流すとサンプル間の移動速度が合わず、BPBのFront Dyeが曲がってしまうこと(スマイリング)があります。このような泳動パターンからは、分子量マーカーによる分子量予測も正確にできませんので、注意が必要です。

サンプル溶液の塩濃度が高い、サンプル間での塩濃度差が大きい、タンパク質濃度が低く濃縮が必要なケースでは、SDS-PAGE Clean-Up Kitなどの沈殿濃縮操作を行い、適切なアプライ量で泳動しましょう。

サンプルのpHについて

Laemmli系で用いられるサンプルバッファーのpHは、pH6.8が一般的です。Laemmli系では、濃縮ゲルのpHがp6.8、分離ゲルのpHは8.8です。サンプル溶液のpHが6.8からずれていると、濃縮ゲル中でのサンプル濃縮がうまくゆかず、シャープなバンドを検出できません。たとえば、TCA沈殿したサンプルの洗浄が不十分であると、サンプル内に残存するTCAの影響でpHが酸性側にずれることがあります。

このようにpHに偏りのあるサンプルを泳動する際には、事前にpH試験紙でサンプルのpH状態を確認しておくとよいでしょう。pHが酸性側にずれている場合は、微量の1.5 M NaOHを加えることでpHを調整できます。



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